什么是PASS技術(shù)

平行等位基因特異性序列檢測(cè)技術(shù)（Parallel Allele－specific  Sequencing，PASS）是一種基于固相PCR反應(yīng)、檢測(cè)病原微生物基因組序列中單個(gè)堿基的突變的新技術(shù)，其工作原理是將待測(cè)DNA或逆轉(zhuǎn)錄后cDNA與聚丙烯酰胺制備成混合液，形成凝膠后，進(jìn)行膠內(nèi)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物積聚到單個(gè)DNA模板附近并在擴(kuò)增點(diǎn)形成清晰的斑點(diǎn)；用不同熒光素標(biāo)記單核苷酸，引物進(jìn)行單核苷酸延伸可摻入不同顏色標(biāo)記的堿基，然后通過(guò)掃描成像區(qū)分出顏色不同野生型和突變型。通過(guò)多次單堿基延伸反應(yīng)，PASS技術(shù)可以檢測(cè)單個(gè)分子內(nèi)多個(gè)突變位點(diǎn)。

PASS技術(shù)不但能敏感的檢測(cè)出DNA模板上的多個(gè)突變位點(diǎn)，還可通過(guò)平行分析，判斷同一基因組中不同突變位點(diǎn)的存在，進(jìn)行突變位點(diǎn)的連鎖分析，并能用于大多數(shù)亞型和重組體的檢測(cè)。因此，適用于病毒群中低比例多重耐藥基因的檢測(cè)。

PASS技術(shù)檢測(cè)病毒耐藥基因的優(yōu)勢(shì)在于：

（1）敏感性高：能檢出病毒群中萬(wàn)分之一、甚至千萬(wàn)分之一的耐藥突變基因；

（2）效率高：能同時(shí)分析單個(gè)樣本中的數(shù)千個(gè)病毒基因組；

（3）適用范圍廣：不受病毒重組或者重采樣的影響；

（4）獲取信息全面：能分析耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生在同一基因組中，進(jìn)行連鎖分析。

PASS技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)下載

什么是連鎖分析

PASS技術(shù)能分析耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生在同一基因組中，進(jìn)行連鎖分析。

PASS技術(shù)通過(guò)固相PCR反應(yīng)熒光成像區(qū)的平行分析，能判斷不同突變位點(diǎn)是存在于同一基因組中或是不同基因組中，即突變位點(diǎn)的連鎖分析。

在進(jìn)行病毒耐藥基因檢測(cè)時(shí)，分析不同耐藥突變位點(diǎn)是否存在于一個(gè)基因組中，進(jìn)行耐藥位點(diǎn)的連鎖分析，這對(duì)于抗病毒治療之前的藥物選擇及抗病毒治療過(guò)程中優(yōu)化治療方案和預(yù)測(cè)治療效果極為重要。

一般情況下，同一藥物的耐藥是由多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的存在造成的，而不同耐藥位點(diǎn)的組合對(duì)抗病毒藥物的耐藥存在很大的不同，因此、對(duì)病人進(jìn)行詳細(xì)的耐藥突變位點(diǎn)連鎖分析并準(zhǔn)確地測(cè)定不同耐藥病毒群（攜帶一個(gè)或多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)的病毒）在體內(nèi)的分布情況將對(duì)選擇最佳藥物和防止耐藥的產(chǎn)生有著重要的意義。

PASS技術(shù)與其他耐藥檢測(cè)方法的比較

PASS技術(shù)具有高敏感性、檢測(cè)位點(diǎn)多、信息全面的優(yōu)勢(shì)。

目前，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法（direct PCR sequencing）可用于檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)，它是通過(guò)PCR擴(kuò)增病毒有關(guān)基因片段后，直接測(cè)定PCR產(chǎn)物的基因序列，分析所有已知和可能的耐藥突變位點(diǎn)；是目前公認(rèn)的基因耐藥檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法檢測(cè)敏感性低，只能檢出存在于整個(gè)病毒準(zhǔn)種池中20％以上的耐藥病毒株，不能發(fā)現(xiàn)低比例耐藥株，并且不能確定多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)在同一病毒基因組的組合情況。

實(shí)時(shí)熒光PCR方法（real-time PCR）能敏感、快速準(zhǔn)確檢測(cè)到已知耐藥突變位點(diǎn)，可以檢測(cè)<1%的耐藥病毒群, 但每次僅能檢測(cè)一個(gè)耐藥突變位點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)有可以檢測(cè)HBV 4個(gè)位點(diǎn)的試劑盒，無(wú)法分析所檢測(cè)到的耐藥突變位點(diǎn)在同一基因組中的相互關(guān)系（linkage analysis）。

PASS技術(shù)同目前常用的直接測(cè)序法和實(shí)時(shí)熒光PCR法三種方法的比較見(jiàn)下表。

PASS技術(shù)在乙肝耐藥檢測(cè)上的應(yīng)用

我們引進(jìn)PASS技術(shù)，在世界上首次應(yīng)用于乙肝耐藥基因的檢測(cè)。

HBV感染呈世界性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌 (HCC)。

乙肝抗病毒治療是目前公認(rèn)為可能改變乙肝患者預(yù)后的最有效的治療方法，而隨著長(zhǎng)期服藥，治療時(shí)間的延長(zhǎng)，近年耐藥問(wèn)題凸顯，給臨床治療帶來(lái)很大困擾。

目前的耐藥檢測(cè)方法在檢測(cè)敏感度和耐藥檢測(cè)方面都存在明顯的不足。敏感而信息全面的耐藥檢測(cè)方法對(duì)于能否在耐藥早期及時(shí)察覺(jué)并采取有效地治療干預(yù)具有重要意義。

我們引進(jìn)平行等位基因特異性序列檢測(cè)技術(shù)（Parallel Allele-specific Sequencing, PASS），在世界上首次應(yīng)用于乙肝耐藥基因的檢測(cè)（見(jiàn)下圖），建立了乙肝高敏感、多重耐藥連鎖分析的檢測(cè)方法，并通過(guò)與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院合作，共同組建“國(guó)際抗病毒藥物敏感性研究中心”，應(yīng)用該檢測(cè)方法在乙肝人群中開(kāi)展抗病毒治療中的耐藥情況監(jiān)測(cè)。

PASS技術(shù)應(yīng)用于乙肝的耐藥檢測(cè)結(jié)果

注：上圖顯示同一個(gè)HBV標(biāo)本進(jìn)行四個(gè)不同耐藥位點(diǎn)的連鎖分析結(jié)果，綠色代表野生型，紅色代表突變型。 在A181T位點(diǎn)，該病人僅攜帶低比率耐藥突變毒株(圖a)。在M204V位點(diǎn)，該病人體內(nèi)絕大多數(shù)病毒均含有該耐藥突變位點(diǎn)(圖b)。 在L80V位點(diǎn), 耐藥突變位點(diǎn)沒(méi)有被檢測(cè)到(圖c)。在T184G位點(diǎn)，該病人體內(nèi)絕大多數(shù)病毒攜帶該耐藥位點(diǎn)突變（圖d）。 箭頭表示在同一HBV基因組的A181T耐藥突變, M204V耐藥突變，L80V突變野毒型和T184G耐藥突變。上述結(jié)果顯示發(fā)生在同一個(gè)病毒基因組上的A181T，M204V和T184G突變位點(diǎn)可很容易地用PASS技術(shù)檢測(cè)到。

耐藥基因檢測(cè)技術(shù)服務(wù)

耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)說(shuō)明

 耐藥基因檢測(cè)樣本說(shuō)明

1、免費(fèi)設(shè)計(jì)引物；

2、送樣須知：血清或血漿樣品采樣后立即在低溫下（-20℃或-70℃）保存的樣品，無(wú)反復(fù)凍融。我們不接受您提供的RNA/cDNA樣品，除非您能充分證明所提供RNA/cDNA是高質(zhì)量的。

3、結(jié)果提交：實(shí)驗(yàn)報(bào)告一份，剩余樣本。

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