什么是PASS技術(shù)

平行等位基因特異性序列檢測技術(shù)（Parallel Allele－specific  Sequencing，PASS）是一種基于固相PCR反應(yīng)、檢測病原微生物基因組序列中單個堿基的突變的新技術(shù)，其工作原理是將待測DNA或逆轉(zhuǎn)錄后cDNA與聚丙烯酰胺制備成混合液，形成凝膠后，進(jìn)行膠內(nèi)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物積聚到單個DNA模板附近并在擴(kuò)增點(diǎn)形成清晰的斑點(diǎn)；用不同熒光素標(biāo)記單核苷酸，引物進(jìn)行單核苷酸延伸可摻入不同顏色標(biāo)記的堿基，然后通過掃描成像區(qū)分出顏色不同野生型和突變型。通過多次單堿基延伸反應(yīng)，PASS技術(shù)可以檢測單個分子內(nèi)多個突變位點(diǎn)。

PASS技術(shù)不但能敏感的檢測出DNA模板上的多個突變位點(diǎn)，還可通過平行分析，判斷同一基因組中不同突變位點(diǎn)的存在，進(jìn)行突變位點(diǎn)的連鎖分析，并能用于大多數(shù)亞型和重組體的檢測。因此，適用于病毒群中低比例多重耐藥基因的檢測。

PASS技術(shù)檢測病毒耐藥基因的優(yōu)勢在于：

（1）敏感性高：能檢出病毒群中萬分之一、甚至千萬分之一的耐藥突變基因；

（2）效率高：能同時分析單個樣本中的數(shù)千個病毒基因組；

（3）適用范圍廣：不受病毒重組或者重采樣的影響；

（4）獲取信息全面：能分析耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生在同一基因組中，進(jìn)行連鎖分析。

PASS技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)下載

什么是連鎖分析

PASS技術(shù)能分析耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生在同一基因組中，進(jìn)行連鎖分析。

PASS技術(shù)通過固相PCR反應(yīng)熒光成像區(qū)的平行分析，能判斷不同突變位點(diǎn)是存在于同一基因組中或是不同基因組中，即突變位點(diǎn)的連鎖分析。

在進(jìn)行病毒耐藥基因檢測時，分析不同耐藥突變位點(diǎn)是否存在于一個基因組中，進(jìn)行耐藥位點(diǎn)的連鎖分析，這對于抗病毒治療之前的藥物選擇及抗病毒治療過程中優(yōu)化治療方案和預(yù)測治療效果極為重要。

一般情況下，同一藥物的耐藥是由多個耐藥突變位點(diǎn)的存在造成的，而不同耐藥位點(diǎn)的組合對抗病毒藥物的耐藥存在很大的不同，因此、對病人進(jìn)行詳細(xì)的耐藥突變位點(diǎn)連鎖分析并準(zhǔn)確地測定不同耐藥病毒群（攜帶一個或多個耐藥突變位點(diǎn)的病毒）在體內(nèi)的分布情況將對選擇最佳藥物和防止耐藥的產(chǎn)生有著重要的意義。

PASS技術(shù)與其他耐藥檢測方法的比較

PASS技術(shù)具有高敏感性、檢測位點(diǎn)多、信息全面的優(yōu)勢。

目前，PCR產(chǎn)物直接測序法（direct PCR sequencing）可用于檢測耐藥突變位點(diǎn)，它是通過PCR擴(kuò)增病毒有關(guān)基因片段后，直接測定PCR產(chǎn)物的基因序列，分析所有已知和可能的耐藥突變位點(diǎn)；是目前公認(rèn)的基因耐藥檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法檢測敏感性低，只能檢出存在于整個病毒準(zhǔn)種池中20％以上的耐藥病毒株，不能發(fā)現(xiàn)低比例耐藥株，并且不能確定多個耐藥突變位點(diǎn)在同一病毒基因組的組合情況。

實時熒光PCR方法（real-time PCR）能敏感、快速準(zhǔn)確檢測到已知耐藥突變位點(diǎn)，可以檢測<1%的耐藥病毒群, 但每次僅能檢測一個耐藥突變位點(diǎn)。目前國內(nèi)有可以檢測HBV 4個位點(diǎn)的試劑盒，無法分析所檢測到的耐藥突變位點(diǎn)在同一基因組中的相互關(guān)系（linkage analysis）。

PASS技術(shù)同目前常用的直接測序法和實時熒光PCR法三種方法的比較見下表。

PASS技術(shù)在乙肝耐藥檢測上的應(yīng)用

我們引進(jìn)PASS技術(shù)，在世界上首次應(yīng)用于乙肝耐藥基因的檢測。

HBV感染呈世界性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌 (HCC)。

乙肝抗病毒治療是目前公認(rèn)為可能改變乙肝患者預(yù)后的最有效的治療方法，而隨著長期服藥，治療時間的延長，近年耐藥問題凸顯，給臨床治療帶來很大困擾。

目前的耐藥檢測方法在檢測敏感度和耐藥檢測方面都存在明顯的不足。敏感而信息全面的耐藥檢測方法對于能否在耐藥早期及時察覺并采取有效地治療干預(yù)具有重要意義。

我們引進(jìn)平行等位基因特異性序列檢測技術(shù)（Parallel Allele-specific Sequencing, PASS），在世界上首次應(yīng)用于乙肝耐藥基因的檢測（見下圖），建立了乙肝高敏感、多重耐藥連鎖分析的檢測方法，并通過與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院合作，共同組建“國際抗病毒藥物敏感性研究中心”，應(yīng)用該檢測方法在乙肝人群中開展抗病毒治療中的耐藥情況監(jiān)測。

PASS技術(shù)應(yīng)用于乙肝的耐藥檢測結(jié)果

注：上圖顯示同一個HBV標(biāo)本進(jìn)行四個不同耐藥位點(diǎn)的連鎖分析結(jié)果，綠色代表野生型，紅色代表突變型。 在A181T位點(diǎn)，該病人僅攜帶低比率耐藥突變毒株(圖a)。在M204V位點(diǎn)，該病人體內(nèi)絕大多數(shù)病毒均含有該耐藥突變位點(diǎn)(圖b)。 在L80V位點(diǎn), 耐藥突變位點(diǎn)沒有被檢測到(圖c)。在T184G位點(diǎn)，該病人體內(nèi)絕大多數(shù)病毒攜帶該耐藥位點(diǎn)突變（圖d）。 箭頭表示在同一HBV基因組的A181T耐藥突變, M204V耐藥突變，L80V突變野毒型和T184G耐藥突變。上述結(jié)果顯示發(fā)生在同一個病毒基因組上的A181T，M204V和T184G突變位點(diǎn)可很容易地用PASS技術(shù)檢測到。

耐藥基因檢測技術(shù)服務(wù)

耐藥基因檢測位點(diǎn)說明

 耐藥基因檢測樣本說明

1、免費(fèi)設(shè)計引物；

2、送樣須知：血清或血漿樣品采樣后立即在低溫下（-20℃或-70℃）保存的樣品，無反復(fù)凍融。我們不接受您提供的RNA/cDNA樣品，除非您能充分證明所提供RNA/cDNA是高質(zhì)量的。

3、結(jié)果提交：實驗報告一份，剩余樣本。

聯(lián)系人：吳云

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