近期，國際期刊《Clinical Microbiology and Infection》發(fā)表了基于CRISPR技術(shù)的一種高靈敏性和高特異性檢測乙型肝炎病毒（HBV）DNA的新方法。論文題目是“Highly sensitive and specific detection of HBV DNA and drug resistance mutations utilizing the PCR-based CRISPR-Cas13a system”。該科研成果由.解放軍疾病預(yù)防控制中心宋宏彬研究員科研團(tuán)隊(duì)、軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所周育森研究員科研團(tuán)隊(duì)和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院任鋒科研團(tuán)隊(duì)共同協(xié)作完成。

臨床上主要通過HBV核酸（DNA）檢測和免疫學(xué)檢測進(jìn)行HBV感染的診斷和抗病毒療效的監(jiān)測。目前，國產(chǎn) HBV DNA 檢測大多都存在靈敏度低、特異性及準(zhǔn)確性差、線性范圍窄等缺陷。尤其是對于低病毒載量的患者，極易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，嚴(yán)重影響臨床的抗病毒治療的啟動(dòng)、檢測抗病毒療效的觀察、CHB 特殊人群（輸血、腫瘤、隱匿性感染等）病情的判斷等。高靈敏度HBV DNA檢測在OBI（Occult hepatitis B virus infection，OBI）篩查、術(shù)前檢查、腫瘤患者放、化療后HBV再激活風(fēng)險(xiǎn)評估、抗病毒治療療效與終點(diǎn)評價(jià)以及預(yù)測HBV表面抗原（HBeAg）陰性患者HBV耐藥突變等方面表現(xiàn)出了突出的臨床價(jià)值。雖然國外高靈敏度 HBV DNA 檢測下限達(dá)到 20IU/mL 甚至更低，但從各指南可以看出，國內(nèi)外專家認(rèn)為，HBV DNA越早控制越好，HBV DNA水平降的越低越好。因此更高靈敏度、更高特異性的HBV DNA的方法的建立就顯得尤為重要。

規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）/ CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式。CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)理：當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會將病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR間隔區(qū)；病毒再次入侵時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成一條前體CRISPR RNA（pre-crRNA），pre-crRNA被RNA內(nèi)切酶切割生成含有與病毒靶標(biāo)序列匹配的成熟CRISPR RNA（crRNA），該crRNA引導(dǎo)具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對靶標(biāo)序列進(jìn)行識別和降解。2016年6月，張峰等報(bào)道了Cas13a是一種在crRNA引導(dǎo)下與靶標(biāo)RNA特定位點(diǎn)結(jié)合并切割的核酸內(nèi)切酶，并將Cas13a與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了一個(gè)兼具高特異性和靈敏性的酶解鎖報(bào)告探針（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK）的核酸檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)核酸分子的檢測。2018年，張峰等發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cas12a特異性結(jié)合和切割目標(biāo)雙鏈DNA后，具有非特異性切割單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）的活性，并利用Cas12a的該附屬切割活性開發(fā)了一個(gè)基于DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR非特異性的報(bào)告探針（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）的核酸檢測系統(tǒng)。研究進(jìn)一步證明：基于CRISPR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)快速、精確、便攜式的核酸診斷，其有望成為下一代核酸診斷新技術(shù)。

本研究建立了基于CRISPR技術(shù)的PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法并進(jìn)行了HBV DNA檢測的臨床驗(yàn)證。研究表明：PCR-CRISPR-HBV DNA新方法可以檢測1個(gè)拷貝的HBV DNA，超過目前現(xiàn)有的熒光定量PCR檢測方法。利用312例HBV患者血清標(biāo)本，302例PCR-CRISPR檢測結(jié)果和熒光定量PCR檢測檢測具有一致性，但是10例低拷貝HBV DNA能夠通過PCR-CRISPR方法和數(shù)字PCR方法檢測出來，而熒光定量PCR檢測不出。因此基于CRISPR技術(shù)的PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法具有高度的靈敏性和特異性。

本研究還利用PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法對HBV YMDD核酸變異進(jìn)行了檢測。研究表明：利用424例HBV患者血清標(biāo)本進(jìn)行YMDD耐藥檢測，PCR-CRISPR方法、YMDD qPCR和測序方法都檢測出412例耐藥YMDD位點(diǎn)，但是對于12例耐藥并且低HBV DNA載量的血清樣本，PCR-CRISPR方法檢測陽性，而YMDD qPCR和測序方法卻沒有檢測出來。因此基于CRISPR技術(shù)的PCR-CRISPR的檢測新方法對耐藥基因檢測具有顯著的優(yōu)越性。

綜上，本研究建立了一種新型的、高靈敏性和高特異性檢測HBV DNA和YMDD變異的PCR-CRISPR檢測新方法，這種方法的廣泛應(yīng)用將為HBV感染早期發(fā)現(xiàn)、HBV抗病毒治療評價(jià)和抗病毒藥物的耐藥監(jiān)測提供重要的指導(dǎo)意義。

任鋒，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，2008.9～2010.10在美國加州大學(xué)洛杉磯分校做訪問學(xué)者，師從我國著名肝病專家段鐘平教授。目前任首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院/北京市肝病研究所研究員、教授，肝衰竭課題組PI。入選北京市優(yōu)秀人才，北京市十百千衛(wèi)生人才“百”層次人才，北京衛(wèi)生系統(tǒng)技術(shù)人才學(xué)科骨干。目前主持國家“13.5”（2項(xiàng)），國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2項(xiàng)）、北京市自然科學(xué)基金（面上1項(xiàng)，重點(diǎn)1項(xiàng)）、北京市科委臨床特色研究（首特2項(xiàng)，首診專項(xiàng)1項(xiàng)）、首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目等十余項(xiàng)課題，參加國家 “12.5”、“11.5”等重大專項(xiàng)以及973等科研項(xiàng)目研究。以第一作者和通訊作者發(fā)表科研論文20余篇，分別在《Hepatology》、《Cell death & Disease》、《Journal of Viral Hepatitis》、《PLoS One》等重要國際學(xué)術(shù)期刊上，累計(jì)影響因子達(dá)80余分。獲得2017年度北京市科技獎(jiǎng)（三等獎(jiǎng)）和2017年度中華醫(yī)學(xué)會科技獎(jiǎng)（三等獎(jiǎng)）。申請CRISPR技術(shù)相關(guān)研發(fā)國家發(fā)明專利2項(xiàng)。目前研究圍繞著HBV感染引起的肝衰竭肝損傷的基礎(chǔ)和臨床研究方面以及基于CRISPR技術(shù)研發(fā)傳染病病毒快速檢測方面開展系列研究。