近期，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院任鋒教授科研團(tuán)隊(duì)在國(guó)際期刊《Emerging Microbes & Infections》（IF=19.568）發(fā)表了題為“CRISPR/Cas13a-assisted Rapid and Portable HBV DNA Detection for Low-Level Viremia Patients”的學(xué)術(shù)論文，該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas13a檢測(cè)新技術(shù)，聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RAA），建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA快速、便攜檢測(cè)試紙條。為HBV感染者特別是HBV低病毒血癥患者（LLV）的HBV DNA檢測(cè)提供了一種可視化的、更快的替代方案。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院博士研究生田原、范子豪和徐玲為本研究的共同第一作者，任鋒教授、張向穎副教授和段鐘平教授為共同通訊作者。

世界衛(wèi)生組織（WHO）制定了到2030年消除HBV作為公共衛(wèi)生威脅的戰(zhàn)略，其中主要目標(biāo)之一就是提高HBV檢測(cè)的效率和覆蓋率。然而，在全世界超過(guò)2.5億乙肝病毒（HBV）感染者中，95%以上的患者生活在低收入和中等收入國(guó)家，且僅有12-25%的患者符合診斷和抗HBV治療的條件。此外，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期規(guī)范化的一線抗病毒藥物治療后，越來(lái)越多的患者被檢測(cè)到血漿中持續(xù)或間歇性低水平的HBV DNA陽(yáng)性，稱為低水平病毒血癥（LLV）。因此，本研究旨在推動(dòng)HBV感染檢測(cè)適應(yīng)任何中小型實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，有效的提高HBV檢測(cè)的效率和覆蓋率。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)系統(tǒng)（Cas）作為一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)，因其具有高靈敏度和高特異性的獨(dú)特特性，在過(guò)去的十年中受到了廣泛的關(guān)注并取得了很大的進(jìn)展。CRISPR新技術(shù)被《Nature》認(rèn)為可能是2022年7大“顛覆性”技術(shù)之一。2017年《Science》報(bào)道了美國(guó)麻省理工學(xué)院張峰團(tuán)隊(duì)首次將CRISPR-Cas13a檢測(cè)技術(shù)與重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA/RAA）技術(shù)相結(jié)合，建立新的核酸檢測(cè)技術(shù)SHERLOCK，實(shí)現(xiàn)單拷貝、高特異性核酸檢測(cè)方法。此外，CRISPR系統(tǒng)可利用側(cè)流試紙條快速、便攜的特點(diǎn)，無(wú)需專業(yè)人員即可實(shí)現(xiàn)病原核酸的高靈敏度、高特異性檢測(cè)。目前針對(duì)HBV檢測(cè)的試紙條主要依靠血清學(xué)標(biāo)志物如乙肝表面抗原（HBsAg）等，而針對(duì)HBV DNA的即時(shí)檢測(cè)（POCT）檢測(cè)仍是空白領(lǐng)域。CRISPR/Cas檢測(cè)——新興的核酸分子診斷技術(shù)已經(jīng)滿足了試紙條的敏感性、特異性和低成本的要求，成為即時(shí)檢測(cè)(POCT)的發(fā)展趨勢(shì)。因此，側(cè)流試紙條結(jié)合CRISPR/Cas技術(shù)可為HBV DNA的快速檢測(cè)提供新的平臺(tái)。

本研究利用CRISPR/Cas13a檢測(cè)新技術(shù)聯(lián)合RAA技術(shù)，建立了基于RAA-CRISPR/ Cas13a的HBV DNA的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)大約10000條HBV DNA序列比對(duì)，確定保守區(qū)序列，并基于此序列構(gòu)建crRNA和RAA引物，完成了高特異性crRNA和RAA引物的篩選和驗(yàn)證，并對(duì)此申請(qǐng)了相關(guān)國(guó)家專利（202110200314.6）。其次，該方法可有效鑒定HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒和臨床樣本，且靈敏度為101拷貝/μL，特異度為100%。同時(shí)，也對(duì)整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行了相應(yīng)的條件優(yōu)化。因此，該研究成功有效地建立了一個(gè)HBV DNA的CRISPR/Cas13a檢測(cè)系統(tǒng)。

圖1: 基于RAA-CRISPR/Cas13a檢測(cè)HBV DNA體系的構(gòu)建

本研究將基于RAA-CRISPR/ Cas13a系統(tǒng)與膠體金試紙結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)了快速、便攜地HBV DNA檢測(cè)。通過(guò)不同濃度的HBV陽(yáng)性質(zhì)粒和不同病毒載量的臨床樣本分別對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖2：“消線法”試紙條檢測(cè)原理及不同濃度的HBV陽(yáng)性質(zhì)粒和不同病毒載量的臨床樣本驗(yàn)證

為評(píng)估CRISPR/Cas13a檢測(cè)試紙條的有效性，選取HBV感染的LLV患者進(jìn)行臨床驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)qPCR、CRISPR/Cas13a試紙條檢測(cè)和CRISPR/Cas13a熒光檢測(cè)三種方法的比較，CRISPR/Cas13a試紙條檢測(cè)在LLV患者HBV DNA檢測(cè)中的陽(yáng)性符合率約為87%，陰性符合率為100%。

圖3：針對(duì)HBV感染的LLV患者的CRISPR/Cas13a試紙條檢測(cè)

為進(jìn)一步評(píng)估CRISPR/Cas13a檢測(cè)試紙條的有效性，選取慢性乙型肝炎抗病毒治療患者的動(dòng)態(tài)血漿樣本（111份），以增加臨床樣本數(shù)量進(jìn)行驗(yàn)證。以qPCR為HBV DNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，CRISPR/Cas13a試紙條檢測(cè)抗病毒治療患者動(dòng)態(tài)樣本中HBV DNA的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPA）和陰性預(yù)測(cè)值（NPA）值分別為100%、92.15%、93.75%和100%。

圖4：HBV抗病毒治療患者CRISPR/Cas13a試紙條檢測(cè)HBV DNA分析

綜上所述，這種快速便攜的HBV DNA檢測(cè)試紙條或其他類似檢測(cè)方法將有望迅速擴(kuò)大HBV感染的診斷篩查能力和覆蓋面積，特別是LLV患者。此外，本研究為目前基于PCR的HBV感染診斷提供了一種可視化和更快的替代方案。這將簡(jiǎn)化HBV感染患者抗病毒治療效果的驗(yàn)證過(guò)程，有助于解決HBV感染這一全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。