液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)

一、國(guó)內(nèi)外研究應(yīng)用進(jìn)展

數(shù)字PCR 是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種定量分析技術(shù)。與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)不同的是數(shù)字PCR 不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct進(jìn)行定量，不受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。目前，已有Fluidigm、 Bio-Rad 、Raindance、Life等幾家公司相繼推出了數(shù)字PCR 產(chǎn)品，這些產(chǎn)品已經(jīng)在單細(xì)胞分析、癌癥早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域顯示出巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。其中Raindance公司的液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)是基于油包水的原理，而其他產(chǎn)品則多采用的是微流控芯片技術(shù)。

同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，在擴(kuò)增前，液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)能夠?qū)?/span>PCR反應(yīng)體系快速、均一地制備成1000萬(wàn)個(gè)皮升大小的油包水液滴，實(shí)現(xiàn)每個(gè)液滴中最多含有1個(gè)模板或者不含模板，確保實(shí)現(xiàn)真正的單分子擴(kuò)增, 擴(kuò)增完成后對(duì)包含有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的液滴進(jìn)行計(jì)數(shù)，就可以直接得到DNA模板分子數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。文獻(xiàn)報(bào)道微滴式數(shù)字PCR 具有非常高的敏感性，可以實(shí)現(xiàn)1:200,000 的突變頻率篩查。此外，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，可以同時(shí)開(kāi)展多個(gè)靶分子的定量檢測(cè)，這為我們擴(kuò)大檢測(cè)靶標(biāo)提供了選擇。自從數(shù)字PCR開(kāi)發(fā)以來(lái)，它的技術(shù)優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下領(lǐng)域：

1）稀有變異檢測(cè)

2）拷貝數(shù)變異

3）無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品情況下的核酸定量

4）與二代測(cè)序整合

二、該平臺(tái)在研究所的作用和意義

北京市肝病研究所，為一所市屬公益性科研院所，旨在進(jìn)一步拓寬肝病的研究領(lǐng)域，加快肝病防治工作的進(jìn)程，減少肝臟疾病的發(fā)生，利用佑安醫(yī)院的特色病種，將臨床治療與基礎(chǔ)研究緊密結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)建一支創(chuàng)新、發(fā)展的科研團(tuán)隊(duì)。研究所液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)可以用于治療后HBV、HCV、HIV患者體內(nèi)病毒核酸的絕對(duì)定量，準(zhǔn)確的低拷貝檢測(cè)能力對(duì)于病毒性肝炎患者的臨床治療會(huì)提供良好的支持。根據(jù)已知的腫瘤相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)panels，可以開(kāi)展肝臟腫瘤患者體內(nèi)相關(guān)突變定量檢測(cè)，相比測(cè)序法，數(shù)字PCR具有靈敏性高、操作簡(jiǎn)單、能夠定量等優(yōu)點(diǎn)。此外，數(shù)字PCR還可以用于對(duì)一些尚沒(méi)有定量標(biāo)準(zhǔn)品的病原體的定量檢測(cè)。

三、診斷和科研用途

研究所液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)可以與現(xiàn)有的二代測(cè)序系統(tǒng)，包括Ion Torrent、PGM相結(jié)合。第一、在測(cè)序前，首先利用液滴制備系統(tǒng)將靶核酸制備成單分子，進(jìn)而進(jìn)行測(cè)序，以發(fā)現(xiàn)單基因水平的序列特征。第二、對(duì)于混合基因組中含量較低的核酸分子，通過(guò)制備成單分子測(cè)序，能夠大大提高其敏感性和針對(duì)性。

對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的核酸分子靶突變位點(diǎn)，可以通過(guò)結(jié)果數(shù)字PCR，利用其高靈敏性、操作方便的特點(diǎn)，為稀有變異檢測(cè)技術(shù)臨床應(yīng)用提供條件。例如血漿游離循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）用于腫瘤診斷具有良好的前景。作為一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法，能夠真實(shí)的反映實(shí)體瘤組織中的基因突變圖譜與頻率，是治療效果的評(píng)估及治療后臨床隨訪(fǎng)的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)1:200,000 的突變頻率篩查并且通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，可以同時(shí)開(kāi)展多個(gè)靶分子的絕對(duì)定量檢測(cè)，為一次同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)提供了選擇。

由于數(shù)字PCR的定量可以不依賴(lài)與已有的標(biāo)準(zhǔn)品，因此為特殊病毒、細(xì)菌等病原體的定量檢測(cè)提供了可能。

四、最近幾年發(fā)表的與此相關(guān)的文章

Bian X, Jing F, Li G, et al. A microfluidic droplet digital PCR for simultaneous detection of pathogenic Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes.BiosensBioelectron. 2015 Jul 10;74:770-777.

Mu D, Yan L, Tang H, Liao Y. A sensitive and accurate quantification method for the detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA by the application of a droplet digital polymerase chain reaction amplification system.BiotechnolLett. 2015 Jul 18.

Yu M, Carter KT, Makar KW, et al.MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles.Epigenetics. 2015 Jul 17:1-7

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Mangolini A, Ferracin M, Zanzi MV, et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.Biomark Res. 2015 Jun 6;3:12.

Ferracin M, Lupini L, Salamon I, Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.Oncotarget. 2015 Jun 10;6(16):14545-55.

Gutiérrez-Aguirre I, Ra?ki N, Dreo T, et al. Droplet digital PCR for absolute quantification of pathogens.Methods Mol Biol. 2015;1302:331-47.

Kinugasa H, Nouso K, Tanaka T,et al. Droplet digital PCR measurement of HER2 in patients with gastric cancer.Br J Cancer. 2015 May 12;112(10):1652-5. 

Zhang BO, Xu CW, Shao Y, et al.Comparison of droplet digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring EGFR gene mutation.ExpTher Med. 2015 Apr;9(4):1383-1388. 

Malatinkova E, Kiselinova M, Bonczkowski P, et al. Accurate quantification of episomal HIV-1 two-long terminal repeat circles by use of optimized DNA isolation and droplet digital PCR.J ClinMicrobiol. 2015 Feb;53(2):699-701. 

Taly V, Pekin D, Benhaim L, et al. Multiplex picodroplet digital PCR to detect KRAS mutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients. Clinical chemistry 2013;59:1722-1731.

五、研究所可提供的臨床和科研服務(wù)項(xiàng)目

（一）臨床服務(wù)項(xiàng)目

1.肝癌患者血漿游離循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測(cè)

2.外周血中特異核酸片段定量檢測(cè)，例如cccDNA等

3.特殊病毒、細(xì)菌等病原體的定量檢測(cè)

（二）科研用途

1.基因不穩(wěn)定性分析

2.腫瘤早期標(biāo)志物研究

3.產(chǎn)前診斷

4.基因組DNA 甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)

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