一、流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，FCM）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)細(xì)胞或微粒的理化、生物學(xué)特征進(jìn)行分析以及根據(jù)這些特征精確分選細(xì)胞的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用廣泛，不僅在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究方面必不可少，而且在臨床對(duì)多種疾病的輔助診斷以及治療方面也發(fā)揮出極大作用。

流式細(xì)胞儀通常由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和電子系統(tǒng)三部分組成（圖1）。其工作原理是熒光標(biāo)記的單細(xì)胞液流被激光照射后，發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光并通過(guò)不同濾光片，電子檢測(cè)設(shè)備收集并分析熒光信號(hào)，并將各通道的數(shù)字轉(zhuǎn)換為圖形顯示。

二、北京市肝病研究所流式平臺(tái)構(gòu)成

北京市肝病研究所的流式平臺(tái)由四臺(tái)流式細(xì)胞儀組成，分別是BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀、BD FACSJazz流式細(xì)胞分選儀、ImageStreamX MarkII量化成像分析流式細(xì)胞儀、和CyTOF2質(zhì)譜流式細(xì)胞儀。四臺(tái)流式細(xì)胞儀囊括了細(xì)胞分析、細(xì)胞分選、流式細(xì)胞成像、和高通量無(wú)補(bǔ)償流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)肝病研究具有極其重要的作用。

（一）BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀

BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（圖2）可提供兩激光四色的樣本檢測(cè)，儀器的參數(shù)設(shè)置如表1所示。該儀器操作簡(jiǎn)單，能滿足細(xì)胞凋亡與周期檢測(cè)、DNA倍體分析、熒光報(bào)告基因表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率判定等基本的科研實(shí)驗(yàn)需求。

（二）BD FACSJazz流式細(xì)胞分選儀

BD FACSJazz流式細(xì)胞分選儀（圖3）配置了兩激光六色的熒光檢測(cè)，具體參數(shù)見(jiàn)表2。該儀器機(jī)身小巧，光學(xué)平臺(tái)緊湊，具有新型的液流控制臺(tái)和分選軟件，能夠?qū)崿F(xiàn)常規(guī)的細(xì)胞分選應(yīng)用。BD FACSJazz提供兩路分選，能夠直接看到分選倉(cāng)內(nèi)情況，并有多路視頻信號(hào)對(duì)分選情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，增加了細(xì)胞分選的可控可測(cè)性能。

（三）ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細(xì)胞儀

ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細(xì)胞儀（圖4）具有三激光十二通道的檢測(cè)性能，能夠檢測(cè)的熒光素見(jiàn)表3。該儀器將流式細(xì)胞儀的速度、敏感性和表型分析能力與熒光顯微鏡的細(xì)節(jié)成像能力相結(jié)合，所獲得的廣泛應(yīng)用是無(wú)論單獨(dú)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡都根本無(wú)法做到的。儀器具有十二個(gè)檢測(cè)通道，能夠?qū)νㄟ^(guò)流動(dòng)室的細(xì)胞逐個(gè)采集圖像，并利用圖像分析軟件對(duì)每個(gè)細(xì)胞圖像的形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行量化分析，可廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、干細(xì)胞、病原微生物、海洋學(xué)等多種學(xué)科的研究。

ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉例：

（四）CyTOF2質(zhì)譜流式細(xì)胞儀

CyTOF2流式細(xì)胞儀通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)流式技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的整合，徹底解決了熒光串色的問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)了幾十個(gè)參數(shù)的同時(shí)測(cè)量。其強(qiáng)大的數(shù)據(jù)獲取能力與現(xiàn)代信息生物學(xué)的分析手段緊密結(jié)合，對(duì)生物學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的研究具有重大的推動(dòng)作用。在血液學(xué)領(lǐng)域，它可以對(duì)復(fù)雜的樣品進(jìn)行精細(xì)的免疫分型和信號(hào)通路分析；在免疫學(xué)的研究中，可以對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分群，并對(duì)免疫細(xì)胞的功能多態(tài)性進(jìn)行細(xì)致分析；在癌癥研究領(lǐng)域，它可以對(duì)癌癥組織進(jìn)行精細(xì)的亞群分析，幫助研究者找到與臨床預(yù)后密切相關(guān)的細(xì)胞亞群；在干細(xì)胞研究領(lǐng)域，可以深入探討當(dāng)前技術(shù)下所區(qū)分出的干細(xì)胞群體的異質(zhì)性，對(duì)于以后干細(xì)胞治療等領(lǐng)域具有重要的指導(dǎo)意義。

與傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)相比，CyTOF流式細(xì)胞技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：1）檢測(cè)通道數(shù)量多CyTOF流式細(xì)胞儀中配備的ICP-TOF質(zhì)譜裝置具有非常寬的原子量檢測(cè)范圍（88～210Da），因此可以同時(shí)檢測(cè)上百個(gè)不同的參數(shù)。2）通道間無(wú)干擾，無(wú)需計(jì)算補(bǔ)償ICP質(zhì)譜裝置具有超高的分辨能力，可以完全區(qū)分開用來(lái)標(biāo)記的各種元素（如右圖所示）。所以解決了困擾傳統(tǒng)流式的“串色”問(wèn)題，使實(shí)驗(yàn)流程得到簡(jiǎn)化，也節(jié)約了樣品和試劑。3）金屬標(biāo)簽數(shù)量多，并具有極低的背景金屬標(biāo)簽是通過(guò)多聚螯合物實(shí)現(xiàn)與抗體的共價(jià)偶聯(lián)，這種金屬螯合物與細(xì)胞組分的非特異性結(jié)合極低，同時(shí)選擇作為標(biāo)記的鑭系金屬，在細(xì)胞中的含量基本為零，因此其信號(hào)背景極低。

三、流式技術(shù)平臺(tái)的作用和意義

北京市肝病研究所研究人員長(zhǎng)期從事肝病相關(guān)的研究，對(duì)自噬、信號(hào)通路和免疫學(xué)方面的研究也處于領(lǐng)先水平。肝病研究所擁有上述四臺(tái)流式細(xì)胞儀，十分必要對(duì)大型儀器進(jìn)行合理地規(guī)劃和使用維護(hù)。建立流式技術(shù)平臺(tái)，目的為研究所和佑安醫(yī)院的科研工作服務(wù)。四臺(tái)流式細(xì)胞儀能夠滿足眾多科研工作需求，包括細(xì)胞周期檢測(cè)、自噬與凋亡水平檢測(cè)、各種細(xì)胞表面標(biāo)志測(cè)定、細(xì)胞分選等。

新型的ImageStreamX MarkII量化成像分析流式細(xì)胞儀由于結(jié)合了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微成像技術(shù)，將傳統(tǒng)流式的應(yīng)用范圍拓展到了基于圖像分析結(jié)果的領(lǐng)域，如共定位、細(xì)胞間相互作用、內(nèi)吞等，因此更是實(shí)現(xiàn)高水平科研的利器。無(wú)論是免疫學(xué)、生物化學(xué)等基礎(chǔ)生命科學(xué)研究，或者是腫瘤學(xué)、病理學(xué)等醫(yī)學(xué)相關(guān)研究，量化成像分析流式細(xì)胞儀都有十分廣泛的應(yīng)用。目前利用量化成像分析流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)表了超過(guò)300篇的同行評(píng)議文章，其中已有多篇文章發(fā)表在Science、Nature、Immunity等頂尖雜志上。

將研究所的研究方向和CyTOF流式細(xì)胞儀的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，該平臺(tái)對(duì)研究所的發(fā)展具有重大的作用和意義：在肝癌方面，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)肝癌早期診斷分子，并且CyTOF流式細(xì)胞儀不僅可以細(xì)致觀察出各個(gè)病人組織細(xì)微的差異，也可以從多態(tài)性的群體中總結(jié)出規(guī)律性的結(jié)論，對(duì)癌癥的研究和治療具有重要的指導(dǎo)意義；在肝再生方面，CyTOF流式細(xì)胞儀具有通道多、無(wú)串色的優(yōu)勢(shì)，將極大促進(jìn)干細(xì)胞的研究，并且可以深入細(xì)胞內(nèi)部對(duì)信號(hào)通路、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等進(jìn)行精細(xì)分析；在肝病免疫學(xué)研究方面，CyTOF流式細(xì)胞儀可以進(jìn)行免疫細(xì)胞的自動(dòng)分群，展現(xiàn)細(xì)胞亞群內(nèi)部的多態(tài)性，從而更加深入研究免疫反應(yīng)機(jī)制。

四．流式技術(shù)平臺(tái)的診斷和科研用途

肝臟是人體重要的免疫器官。來(lái)自全身和腸道的血液流經(jīng)肝臟，攜帶了各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也包含了許多抗原物質(zhì)，它們與眾多免疫細(xì)胞在肝臟內(nèi)相互作用，挑戰(zhàn)著肝臟內(nèi)部的免疫穩(wěn)態(tài)。因此，肝臟疾病大多都是免疫穩(wěn)態(tài)被打破的結(jié)果。利用流式細(xì)胞儀可對(duì)HBV感染過(guò)程中各種細(xì)胞的功能狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)合HBV DNA定量檢測(cè)、肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平、凝血酶原水平、血常規(guī)等檢測(cè)，對(duì)肝炎和肝癌發(fā)生發(fā)展和治療起到重要作用。

目前肝病研究中流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用有：

1）常規(guī)檢測(cè)HBV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中各種免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例，如T/B/NK細(xì)胞檢測(cè)、CD4/CD3/CD8/CD45檢測(cè)、Th1/Th2/Th17/Treg檢測(cè)等；

2）檢測(cè)HBV感染患者PBMCs表面的各種免疫分子，如HLA-DR、CD80、CD86、PD-1、CTLA-4、TLRs等；

3）檢測(cè)HBV感染患者血清中的各種細(xì)胞因子水平；

4）檢測(cè)切除肝癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor infiltrated lymphocytes, Tils）組成；

5）細(xì)胞治療：從患者PBMCs中分選感興趣的目的細(xì)胞，在體外進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，再回輸至患者體內(nèi)，達(dá)到免疫治療肝病的目的。常用的免疫回輸細(xì)胞有：細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine induced killer, CIK）；DC-CTL；iAPA（inhibition of antigen presentation attenuators）-DC-CTL；DC-CIK等。

五．北京市肝病研究所流式技術(shù)平臺(tái)可提供的服務(wù)項(xiàng)目

1. 細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)和胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)

2. 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

3. 細(xì)胞周期檢測(cè)

4. 細(xì)胞增殖檢測(cè)

5. 細(xì)胞分選

6. 成像流式檢測(cè)，包括熒光信號(hào)共定位、內(nèi)化、蛋白質(zhì)核轉(zhuǎn)位、細(xì)胞形變等

7. 質(zhì)譜流式檢測(cè)

以上服務(wù)均為收費(fèi)項(xiàng)目，如有使用需求，請(qǐng)與平臺(tái)負(fù)責(zé)人聯(lián)系。聯(lián)系電話：83997425。

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