近期，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院任鋒教授科研團隊在國際期刊《Emerging Microbes & Infections》（IF=13.2）發(fā)表了題為“CRISPR/Cas13a-Assisted Accurate and Portable Hepatitis D Virus RNA Detection”的學(xué)術(shù)論文，該團隊利用CRISPR/Cas13a檢測新技術(shù)，聯(lián)合等溫擴增技術(shù)（RAA），建立了基于RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/ Cas13a的HDV RNA快速、便攜檢測方法。該方法為監(jiān)測HDV感染的發(fā)生發(fā)展和評價治療效果提供了新的手段。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院博士研究生田原、范子豪和張向穎副教授為本研究的共同第一作者，任鋒教授和軍事醫(yī)學(xué)研究院李浩教授為共同通訊作者。

HDV是一種單股環(huán)形負(fù)鏈RNA病毒，由HBsAg外殼和HDV核心顆粒組成，核心顆粒包含1672~1697 個堿基。HDV是缺陷病毒，需要借助HBV來完成其生命周期。在全球普通人群中HDV的總患病率約為0.80%，在HBsAg攜帶者中HDV總患病率約為13.02%，相當(dāng)于全球約有4800-6000萬的HDV感染者。與其他型肝炎病毒感染比較，HDV感染進展速度更快，約70%丁型肝炎患者于5-10年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，15%的患者僅需1-2年即可進展為肝硬化。HDV/HBV合并感染者發(fā)生肝硬化和肝癌的風(fēng)險較HBV單獨感染者高。因此，本研究旨在建立一種精準(zhǔn)便攜的HDV核酸檢測方法，為HDV感染的盡早發(fā)現(xiàn)和治療提供幫助。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)系統(tǒng)（Cas）作為一種新型的核酸檢測技術(shù)，因其具有高靈敏度和高特異性的獨特特性，在過去的十年中受到了廣泛的關(guān)注并取得了很大的進展。CRISPR新技術(shù)被《Nature》認(rèn)為可能是2022年7大“顛覆性”技術(shù)之一。2017年《Science》報道了美國麻省理工學(xué)院張峰團隊首次將CRISPR-Cas13a檢測技術(shù)與重組酶聚合酶擴增（RPA/RAA）技術(shù)相結(jié)合，建立新的核酸檢測技術(shù)SHERLOCK，實現(xiàn)單拷貝、高特異性核酸檢測方法。此外，CRISPR系統(tǒng)可利用側(cè)流試紙條快速、便攜的特點，無需專業(yè)人員即可實現(xiàn)病原核酸的高靈敏度、高特異性檢測。目前針對HDV檢測的試紙條主要依靠丁型肝炎病毒抗原抗體檢測，而針對HDV RNA的即時檢測（POCT）檢測仍是空白領(lǐng)域。CRISPR/Cas檢測——新興的核酸分子診斷技術(shù)已經(jīng)滿足了試紙條的敏感性、特異性和低成本的要求，成為POCT的發(fā)展趨勢。因此，側(cè)流試紙條結(jié)合CRISPR/Cas技術(shù)可為HDV RNA的快速檢測提供新的平臺。

圖1：基于CRISPR-Cas13a的HDV RNA檢測原理示意圖

本研究利用CRISPR/Cas13a檢測新技術(shù)聯(lián)合RT-PCR/RT-RAA技術(shù)，建立了RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/Cas13a的HDV RNA的檢測方法。通過對大約500條HDV基因序列比對，確定保守區(qū)序列，并基于此序列設(shè)計和篩選出了最佳的RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA，并對此申請了相關(guān)國家專利（202311065728.8）。

圖2：RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA的設(shè)計和篩選

其次，該方法可有效鑒定HDV RNA陽性質(zhì)粒和陽性臨床樣本，且靈敏度為1拷貝/μL。同時，也對整個檢測反應(yīng)進程進行了相應(yīng)的條件優(yōu)化。因此，該研究成功有效地建立了一個HDV RNA的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)。

圖3：使用合成HDV RNA陽性質(zhì)粒評估RT-PCR-CRISPR和RT-RAA-CRISPR方法。

本研究將基于RT-RAA-CRISPR/ Cas13a系統(tǒng)與膠體金試紙結(jié)合使用，實現(xiàn)了快速、便攜地HDV RNA檢測。并通過HDV RNA陽性質(zhì)粒和陽性臨床樣本分別對該方法進行了驗證。

圖4：HDV RNA的RT-RAA-CRISPR橫向側(cè)流試紙條檢測

為進一步評估CRISPR/Cas13a檢測方法的有效性，選取144例IgG陽性的臨床血漿樣本進行驗證。分別用RT-qPCR、RT-ddPCR、RT-PCR-CRISPR熒光法和RT-RAA-CRISPR試紙條法進行比較。其中，RT-PCR-CRISPR熒光法的檢測率（81.9%）和RT-RAA-CRISPR試紙條法的檢出率（72.2%）均高于RT-qPCR（66.7%）和RT-ddPCR（76.4%）。

圖5：IgG陽性患者的HDV RNA檢測

綜上所述，我們開發(fā)了新的RT-PCR-CRISPR熒光法和RT-RAA-CRISPR試紙條檢測HDV RNA的方法，該方法不僅靈敏度高、特異性強，而且耗時少、操作方便。這項研究為監(jiān)測疾病的發(fā)生和發(fā)展以及評估治療效果提供了一個強有力的工具。